Uma plataforma versátil de microarranjos para captura de células raras

Aug 09, 2023

Scientific Reports volume 5, Artigo número: 15342 (2015) Citar este artigo

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As análises de eventos raros que ocorrem em frequências extremamente baixas em fluidos corporais ainda são um desafio. Estabelecemos uma plataforma versátil baseada em microarranjos, capaz de capturar células-alvo únicas de grandes populações de fundo. Como caso de uso, escolhemos a aplicação desafiadora de detecção de células tumorais circulantes (CTCs) – cerca de uma célula em um bilhão de células sanguíneas normais. Após a incubação com um coquetel de anticorpos, as células-alvo são extraídas em um microarranjo em um chip microfluídico. A acessibilidade da nossa plataforma permite a posterior recuperação de alvos para análise posterior. O microarranjo facilita a exclusão de eventos de captura falsos positivos por co-localização, permitindo a detecção sem marcação fluorescente. A análise de amostras de sangue de pacientes com câncer com nossa plataforma alcançou e ultrapassou parcialmente o desempenho do padrão ouro, demonstrando viabilidade para aplicação clínica. Os pesquisadores clínicos escolhem livremente o coquetel de anticorpos, sem necessidade de alteração na fabricação de chips ou no protocolo de incubação, permitindo o direcionamento arbitrário virtual de espécies de captura e, portanto, aplicações amplamente difundidas em ciências biomédicas.

A detecção e caracterização molecular de subconjuntos específicos de células únicas que ocorrem em frequências extremamente baixas em fluidos corporais tem um potencial importante na biomedicina como ferramenta de diagnóstico, mas ainda é tecnicamente um grande desafio, apesar dos enormes esforços realizados nos últimos dez anos. Fluidos como sangue, urina, líquido pleural, líquido cefalorraquidiano ou ascite desempenham um papel central no diagnóstico médico, sendo o sangue a fonte de informação mais amplamente utilizada. Além da análise de moléculas derivadas de células (por exemplo, proteínas, ácidos nucleicos e metabólitos), a análise de células inteiras que circulam no sangue pode revelar informações mais complexas sobre a causa e o estado real de uma doença específica nos níveis de DNA, RNA e proteínas. nível. Exemplos de aplicações em pesquisa básica e aplicada são a análise de subconjuntos raros de células T no sangue periférico de pacientes com distúrbios imunológicos ou doenças infecciosas1, bem como células tumorais circulantes (CTCs) em pacientes com câncer, que podem ser consideradas como uma “biópsia líquida”. ”2,3, um novo conceito de diagnóstico4 que ganhou enorme interesse nos últimos cinco anos5,6,7,8. As metástases à distância são a principal causa de morte relacionada ao câncer9 e começam com a liberação de células cancerígenas do tumor primário sólido (por exemplo, câncer de mama) na corrente sanguínea10,11. Estas CTCs podem instalar-se em órgãos distantes (por exemplo, pulmão, fígado, osso ou cérebro) e eventualmente formar lesões metastáticas. A análise das CTCs oferece insights importantes sobre a biologia da progressão metastática e novas perspectivas no tratamento da metástase do câncer12,13. No entanto, o enriquecimento e a identificação de CTCs a partir de uma amostra de sangue ainda é um grande desafio, mesmo após décadas de investigação, uma vez que a proporção entre CTCs e células sanguíneas é de aproximadamente 1:109 (assumindo < 200 CTCs/ml, 5 × 109 RBCs/ ml, 7 × 106 leucócitos/ml)14. Muitas estratégias diferentes de enriquecimento para CTCs dependem de uma seleção positiva visando a molécula de adesão de células epiteliais (EpCAM) e várias abordagens microfluídicas foram desenvolvidas mostrando resultados promissores . As superfícies revestidas com anti-EpCAM interagem com as moléculas de EpCAM na membrana celular que imobilizam as CTCs, enquanto as células sanguíneas transmitem o sistema. A verificação e posterior análise das células capturadas são realizadas por imunocoloração ou outras abordagens5. No entanto, estudos recentes mostraram que o EpCAM nem sempre é um marcador confiável, uma vez que também foram descobertas CTC negativas para EpCAM no sangue de pacientes com câncer25,26,27. Abordagens baseadas em superfícies revestidas com anticorpos homogêneos lutam com baixa especificidade, tornando-as potencialmente ineficazes para aplicações práticas. Por conta disso, o desenvolvimento de dispositivos de captura de CTC que (i) possam facilmente atingir uma ampla gama de diferentes epítopos de superfície, (ii) sejam capazes de lidar com grandes volumes de sangue, (iii) exibam uma alta especificidade e (iv) permitam uma única a análise celular ainda é desafiadora, mas altamente exigida.